梁文轩  (特任研究员)

主要研究领域

活体光学显微成像旨在无创地观察活体组织或模式动物体内的（亚）细胞结构并跟踪其功能动态，在生命科学和临床诊疗两方面都有广泛的应用。

相比于离体的组织切片或贴壁培养的细胞等薄样本，对活体组织的成像有两大特点，同时也是技术挑战：一是需要三维分辨（也称深度层析）能力以直接探查厚样本，二是需要具备足够的四维时空分辨率（三维空间 x 一维时间）来捕捉活体的动态功能信息。

随着新型钙离子敏感荧光蛋白和能分辨单个动作电位的电压敏感分子荧光探针的发展，神经科学界亟需具备更高时空分辨率的新型三维活体显微成像技术。如何创新成像原理和采集策略，不断提升活体三维显微成像的时空分辨率、视场范围、成像深度等核心性能指标，是本课题组未来的战略方向之一。

另一方面，在诸如无创（早期）诊断、活检辅助、精微手术导航、治疗随访等临床诊疗场景中，成像装置的小型化、微型化至关重要。如何通过架构设计和核心元器件等方面的突破，创制能够实时、无创、原位在体地获取表皮下组织的三维微观病理学结构和功能信息的手持式或内窥式小型（微型）显微探头，达到“无需切片、胜似切片”的成像效果，是本课题组另一个战略方向。

以往研究成果

1. 设计构建了国际首例面向临床原位在体实时三维病理学显微的小型化SCAPE显微镜，在主物镜孔径光阑直径减小2/3、整机占地面积缩小4/5的同时，仍取得了与台式SCAPE设备同等水平的荧光收集效率和三维分辨率（0.81 µm × 1.07 µm × 2.10 µm），实现了仅靠内源性自体荧光的在体大范围全景体积成像。SCAPE显微术的高时空分辨三维体积成像优势能够有效对抗活体组织运动的干扰，有望实现 “无需切片、胜似切片” 的原位在体、大范围、三维病理学显微成像。

要在临床诊疗场景中应用SCAPE显微成像，一个必备条件是构建相匹配的小型化乃至微型化SCAPE探头。然而标准台式SCAPE显微镜的核心光路高度复杂，为小型化带来了挑战。本人从SCAPE显微术核心原理出发，首先将光片生成透镜组与荧光探测物镜整合为后端正交光片收发模组，避免了台式SCAPE光路所需的二向色镜和分叉光路，显著简化了光路设计；进而设计了桥接第二物镜与主物镜的前端级联4f系统模组，将后端正交光片收发模组的虚拟样品区与主物镜前端的开放样本空间共轭耦合，并通过优化折叠使得前端模组光路更加紧凑（如下图a-b所示）。

动物实验表明，该小型SCAPE显微镜能够仅靠自体荧光清晰可视化肝、肾等小鼠器官组织的细胞级微观结构（如下图c所示）；在健康志愿者无标记的舌头上仅需6.4毫瓦激发功率便能取得4.8体积/秒的三维体积率，且在志愿者自由伸缩舌头时，能够从所得的高速“三维体数据流”中直观而准确地估计出相邻体数据块之间的三维位移，进而经配准融合生成覆盖若干毫米范围的三维全景拼接图像（下图d）——由此验证了该小型SCAPE显微镜对活体组织运动出色的抗干扰能力和临床应用潜力。

2. 主导研发了两代基于柔性光纤扫描的微型双光子显微内窥成像技术

a) 系统深入地研究了制约双光子显微内窥镜成像信噪比的关键因素，并研究提出了相应的解决方案： (1) 阐明了长期被忽略的背景噪声——常规掺锗纤芯在激发光脉冲作用下的非线性发光，并利用基于无掺杂纯硅纤芯的定制双包层光纤将非线性背景噪声降至市售双包层光纤的1/4以下；(2) 建立了双光子内窥镜的后向荧光收集模型，指导优化了定制微型GRIN 物镜的色差补偿和定制双包层光纤内包层的光学扩展量，使荧光收集效率提升了约2.5倍；（3）发展了非线性时频联合色散补偿理论与方法，克服了自相位调制效应导致的脉冲频谱压缩，将双光子激发效率相比于传统的线性补偿方法提升了2~3倍。综合上述原理与架构创新，构建了直径仅2.2毫米的“第一代”微型双光子显微内窥探头（见图a），将探测灵敏度相对于此前设计提升了20倍以上，突破了长期制约光纤双光子内窥技术的成像信噪比瓶颈，实现了可实用的活体无标记实时双光子内窥显微成像（见图b）。

b) 提出了数值孔径级联放大的设计策略，显著提升了第二代光纤扫描双光子显微内窥镜的空间-带宽-成像速度三重积。前述的“第一代”双光子显微内窥镜的视场范围（约100微米直径）和成像速度（约2帧/秒）都有待提高，然而光纤悬臂共振扫描架构需要在视场直径（正比于悬臂长度）与扫描速度（正比于共振帧率）之间取舍。因此，申请人首先从理论上论证了光纤共振扫描显微探头的空间-带宽-速度三重积正比于悬臂出射NA的平方；进而创新提出NA级联放大的设计策略，并利用现成光学元件构建了出射NA ~ 0.35的单模复合光纤悬臂（见图d），打破了传统单模光纤NA约为0.12的物理限制。由此申请人研制了空间-带宽-成像帧率乘积显著提升的“第二代”双光子显微内窥镜，在保证同等分辨率和双光子激发效率的前提下，能够实现：（1）速度不变、视场直径扩展3倍（空间带宽积扩展约9倍；见图11e），或（2）视场直径扩展1.5倍、成像帧率提升3倍，验证了NA级联策略的可行性与灵活性。

c) 发展了能同步采集光学氧化还原比（optical redox ratio）和NADH荧光寿命的无标记双光子显微内窥代谢成像方法，首次展示了在活体动物模型上的内窥式双光子无标记结构与代谢功能双成像。深入研究了背景光子的到达时间分布和NADH荧光的弱光子流特性，发展了基于最大似然估计的双指数拟合算法，显著改善了数据分析的准确率，实现了对游离态NADH和结合态NADH的区分定量表征。动物实验表明，该系统能够跟踪活体小鼠皮质肾小管上皮细胞在缺血-再灌注过程中氧化还原比的动态变化和胞内游离态NADH与结合态NADH的丰度涨落（如图11c所示），以及小鼠皮下移植肿瘤细胞在诱导凋亡过程中胞内游离态和结合态NADH的丰度和荧光寿命的变化。

更多阅读：“无需切片、胜似切片”：中国学者开发小型化在体实时三维显微成像设备

参考文献

1.   Liang W, Chen D, Guan H, Park HC, Li K, Li A, Li MJ and Li X. Label-Free metabolic imaging in vivo by two-photon fluorescence lifetime endomicroscopy. ACS Photonics, 9(12), 4017-4029 (2022) https://doi.org/10.1021/acsphotonics.2c01493

2.   Patel KB, Liang W, Casper MJ, Voleti V, Zhao HT, Perez-Campos C, Liu JM, Coley SM, and Hillman EMC. High-speed light-sheet microscopy for the in-situ acquisition of volumetric histological images of living tissue. Nature Biomedical Engineering 6, 569-583 (2022) https://doi.org/10.1038/s41551-022-00849-7

3.   Liang W, Park HC, Li K, Li A, Chen D, Guan H, Yue Y, Gau YT, Bergles DE, Li MJ, Lu H, and Li X. Throughput-speed product augmentation for scanning fiber-optic two-photon endomicroscopy. IEEE Transactions on Medical Imaging 39(12), 3779-3787 (2020) https://doi.org/10.1109/TMI.2020.3005067

4.   Li K*, Liang W*, Yang Z, Liang Y, and Wan S. Robust, accurate depth-resolved attenuation characterization in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express 11(2), 672-687 (2020) *Equal contribution https://doi.org/10.1364/BOE.382493

5.   Voleti V, Patel KB, Li W, Campos CP, Bharadwaj S, Yu H, Ford C, Casper MJ, Yan RW, Liang W, Wen C, Kimura KD, Targoff KL, and Hillman EMC. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods 16(10), 1054–1062 (2019) https://doi.org/10.1038/s41592-019-0579-4

6.   Li K, Liang W, Mavadia-Shukla J, Park HC, Li D, Yuan W, Wan S, and Li X. Super-achromatic optical coherence tomography capsule for ultrahigh‐resolution imaging of esophagus. Journal of Biophotonics 12(3), e201800205 (2019) https://doi.org/10.1002/jbio.201800205

7.   Liang W*, Hall G*, and Li X. Spectro-temporal dispersion management of femtosecond pulses for fiber-optic two-photon endomicroscopy. Optics Express 26(18), 22877-22893 (2018) *Equal contribution https://doi.org/10.1364/OE.26.022877

8.   Liang W, Hall G, Messerschmidt B, Li MJ, and Li X. Nonlinear optical endomicroscopy for label-free functional histology in vivo. Light: Science and Applications 6, e17082 (2017) https://doi.org/10.1038/lsa.2017.82